Задать вопрос врачу
Спросить на форуме

Типирование вируса папилломы человека и атомно–силовая микроскопия при папилломавирусной инфекции у женщин

15 января 2012 - Администратор

Папилломавирусная инфекция (ПВИ), подобно другой группе опухолеродных инфектогенов – герпесвирусам, в настоящее время является предметом широкомасштабных научных изысканий, что определяется резким подъемом заболеваемости, высокой контагиозностью и установленным онкопотенциалом вирусов папилломы человека (ВПЧ) [1,4].
Клинически выраженная, субклиническая и латентная формы ВПЧ встречаются у 30,3% населения европейского региона нашей страны [2]. Прирост заболеваемости раком шейки матки в России с 2002 по 2006 гг. составил 20,3%. В мире ежегодно регистрируется около 600 тыс. новых случаев рака шейки матки с более чем 250 тыс. смертельных исходов. Вирусная природа рака шейки матки подтверждена Всемирной организацией здравоохранения. Эпидемиологические и вирусологические исследования свидетельствуют, что ~95% всех видов плоскоклеточного рака шейки матки имеют связь с наличием ВПЧ, при определенной поддержке со стороны другой онковирусной системы – герпесвирусов, способствующих инициации ВПЧ–активности.
ВПЧ относится к подгруппе А семейства Papoviridae. Таксономически вирусы папилломы человека делятся на роды (обозначаются греческими буквами), виды (обозначаются арабскими цифрами и буквой рода), типы (обозначаются арабскими цифрами). Идентифицированы более 140 серотипов ВПЧ, 35 типов вызывают поражения покровного эпителия и слизистых оболочек половых органов. Выделены группы ВПЧ высокого (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51) и низкого (6, 11, 42–44) онкогенного риска. Первые обнаруживают в 95–100% биоптатов рака шейки матки, вторые ассоциированы с доброкачественными экзофитными бородавками аногенитальной локализации.
ВПЧ – это мелкий безоболочечный ДНК–содержащий вирус с кольцевым dS геномом размером 7200–8000 пар оснований, особенностью которого является мощное пролиферативное воздействие на эпителиоциты кожи, слизистых оболочек гениталий и других органов (гортань, бронхи, ротовая полость, глаза). В процессе репликационного цикла генетический аппарат ВПЧ экспрессирует 8–10 белков, разделенных на 3 функционально дифференцированные области (LCR – длинный контрольный регион, Е (early – ранняя) и L (late – поздняя)). Регион LCR контролирует транскрипцию вирусного генома, E – инициирует функционирование ранних генов (E1, E2, E4, Е5, E6, E7), экспрессирующих белки, ответственные за репликацию вирусного генома. Область L генома ВПЧ состоит из L1– и L2–участков геномных последовательностей, детерминирующих структурные белки капсида ВПЧ. Онкопротеинами являются белки Е6 и Е7, оказывающие ингибиторное воздействие на функционирование гена интерлейкина–18, одного из доминирующих факторов формирования иммунореактивности лимфоцитов CD8+. Снижается экспрессия генов главного комплекса гистосовместимости. Е5, ассоциируясь с ИЛ–18, препятствует индукции γ–интерферона. Вышеназванные структурно–функциональные особенности ВПЧ обусловливают недостаточную эффективность иммунных реакций для блокирования развивающейся инфекции.
Заражение ВПЧ приводит к персистенции генома вируса в эписомальной форме в клетках с продукцией вирусных частиц, с последующей поликлональной интеграцией вирусной ДНК в клеточный геном, индукцией мутаций в клеточной ДНК, вызывающей нестабильность генома, «селекцией» клона клеток с мутантной ДНК, содержащего интегрированную вирусную ДНК, активным размножением данного клона клеток и ростом опухоли.
Инфицирование ВПЧ кожно–слизистых мембран половых органов происходит при наличии микротравм. Генитальная ВПЧ–инфекция часто бывает мультифокусной и ассоциированной, как правило, более чем с одним типом ВПЧ. Наиболее типичные проявления ПВИ делятся на экзофитные, к которым относятся остроконечные кондиломы, и эндофитные, к которым относятся плоские, инвертирующие кондиломы. Существуют и субклинические, и латентные формы. Пациентки с данной патологией входят в группу риска по возникновению осложнений при беременности и в родах, пороков развития плода и плаценты, осложнений после малых гинекологических операций [2].
Стандартный набор диагностических процедур при обследовании на ПВИ включает расширенную кольпоскопию, цитологическое исследование, геномную амплификацию ДНК ВПЧ, ДНК–гибридизацию, определение онкобелка Е7 и др. Чувствительность цитологических методов варьирует от 50 до 80% [3]. Недостатки цитологического исследования создают необходимость внедрения современных технологий, которые могли бы уменьшить число ложноотрицательных результатов тестов.
Уже более 6 лет в НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (лаборатория герпесвирусов с КДЦ, руководитель – проф. Н.Д. Львов) проводится научная работа по параллельному изучению двух опухолеродных вирусных систем – герпес– и папилломавирусной и механизмов их взаимодействия [1,4]. Проведена также работа по изучению структуры поверхности эпителиальных клеток шейки матки, инфицированных ВПЧ, с использованием атомно–силовой микроскопии (АСМ) [Маныкин А.А., 2009].
Целями настоящего исследования явились изучение возможности применения метода АСМ для улучшения качества диагностики ПВИ и адаптация метода для практического здравоохранения.
Материалы и методы исследования
В исследование включено 149 женщин в возрасте от 16 до 35 лет (средний возраст составил 23,3±2,8 года) с верифицированной ПВИ. Длительность заболевания колебалась от 1 до 6 мес.
Принцип метода АСМ заключается в следующем: микроскоп сканирует поверхность образца при помощи острой иглы (1~2 микрона, d<100 ангстремов). Игла располагается на свободном конце треугольной микробалки (кантеливера), которая покрыта отражающим материалом – чаще золотом. Кантеливеры обычно имеют длину от 100 до 200 микрон, ширину – от 10 до 40 микрон и толщину – от 0,3 до 2 микрон.
Кантеливер фиксирует силу, прилагаемую к образцу. Сила, возникающая между иглой и поверхностью образца, вызывает отклонение кантеливера. Эта межатомарная сила (Ван–дер–Ваальсова) зависит от расстояния между иглой и образцом. АСМ имеет два режима работы: контактный и неконтактный. При контактной АСМ происходит сканирование на расстоянии нескольких ангстремов от поверхности объекта. Межатомарная сила между иглой и объектом в данном случае – это сила отталкивания. Расстояние между иглой и образцом при неконтактной АСМ составляет несколько десятков ангстремов, при этом между иглой и объектом возникает межатомарная сила притяжения. Детектор измеряет степень отклонения кантеливера по смещению отраженного от его зеркальной поверхности лазерного луча, по мере того, как игла проходит над образцом. На основании этих данных компьютер составляет карту топографии поверхности исследуемого объекта.
АСМ позволяет получить информацию о высоте и трехмерной организации, а также о ряде локальных поверхностных свойств, таких как жесткость и вязкость. АСМ – это единственный метод микроскопии, позволяющий исследовать биообъекты в естественном водном окружении (in vivo). Для исследования методом АСМ поверхности клеток можно использовать цитологические препараты из мазков, окрашенных гематоксилин эозином по Карацци, взятых в зоне трансформации шейки матки пациенток. Материал для цитологического исследования брался с использованием щеток «Цитобраш» из цервикального канала, эндо– и экзоцервикса. Для генотипирования вирусов папилломы человека 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 58, 59, 66, 6, 11 типов использовали наборы реагентов «АмплиСенс» производства ФГУН «ЦНИН эпидемиологии» Роспотребнадзора.
Результаты исследования
и их обсуждение
Проведено клинико–лабораторное обследование 149 пациенток с ПВИ с использованием клинико–визуального метода, цитологического метода, АСМ, геномной амплификации ДНК ВПЧ, урогенитальных инфекций. В нашем исследовании мы наблюдали интенсификацию вагинальных выделений у женщин с ПВИ. Влияние ПВИ на микробиоценоз влагалища изучали путем выявления частоты встречаемости вагинитов у обследованных женщин.
У 47 (31,5%) женщин отмечено отсутствие изменений в микробиоценозе влагалища. Вагиниты встречались у 102 (68,5%) пациенток (р>0,05). Среди жалоб при ПВИ жжение отмечалось в 81,5% случаев, зуд – в 66,7%, бели – в 92,6% случаев. Моноинфекция наблюдалась в 17,6% случаев, смешанная вирусная инфекция (ВПГ + ВПЧ) – в 32,4%, ВПГ + ВПЧ + ЦМВ инфекция – в 50% случаев (рис. 1). Смешанная бактериально–вирусная инфекция: ВПЧ в сочетании с Ureaplasma urealyticum – в 18% случаев, ВПЧ в сочетании с Mycoplasma hominis – в 1,3%, с Gardnerella vaginalis – в 23,5%, с Chlamydia trachomatis – в 2,7%.
Остроконечные кондиломы мы наблюдали у 12 (12,4%) пациенток, папиллярные кондиломы – у 7 (4,7%), кератотические бородавки – у 9 (6%). Субклиническая форма ПВИ была у 44 (29,5%) пациенток, латентная форма – у 57 (38,3%), ВПЧ–ассоциированные заболевания – у 38 (25,5%). Результаты типирования ДНК ВПЧ представлены на рисунке 2. При цитологическом исследовании мазков с шейки матки койлоцитоз отмечался в 51 (34,3%) случае, дискератоз – в 2 (1,3%), паракератоз – в 3 (2%), гиперкератоз – в 2 (1,3%) случаях. Данные цитологического исследования были дополнены АСМ.
При цитологическом исследовании клетки плоского эпителия поверхностного слоя без признаков патологии выглядели как полигональные клетки с пикнотичными ядрами (рис. 3); цитоплазма нежная, прозрачная, контуры четкие, неровные. При АСМ можно получить трехмерное изображение такой клетки, наблюдать ее рельеф (рис. 4).
Наличие койлоцитов – основной цитологический признак папилломавирусного поражения эпителия. Это клетки плоского эпителия неправильной формы, разного размера, с четкими контурами и наличием околоядерной зоны просветления с неровными границами и четко очерченной цитоплазмой по периферии; ядра гиперхромные, разной степени увеличения, мембрана неровная, складчатая. На рисунке 5 представлено трехмерное изображение описанного выше койлоцита. В центральной части отмечена выпуклая зона, окруженная глубоким провалом, за которым виден подъем рельефа по периферии клетки. Сопоставляем эту картину с цитологическим исследованием: выпуклая зона соответствует ядру, углубление – зоне просветления цитоплазмы, подъем рельефа по периферии клетки – зоне уплотнения цитоплазмы.
Дискератоцит – второй основной цитологический признак ПВИ. Это эпителиальная клетка небольших размеров, вытянутой формы, с вытянутым гиперхромным ядром и плотной блестящей цитоплазмой. При анализе изображения в одних участках наблюдается высота цитоплазмы до 1400 нм, а в других участках – падение высоты цитоплазмы до 800 нм, в зоне ядра высота поверхности клетки – 1250 мм. На рисунке 6 виден небольшой перепад высот поверхности дискератоцита.
Паракератоцит – мелкая одиночная клетка плоского эпителия полигональной формы, с округлым ядром, расположенным центрально, со зрелой цитоплазмой. При АСМ–исследовании паракератоцит имеет более значительную высоту клетки, без перепадов высот, с ядром и цитоплазмой 1550 и 1450 нм соответственно. Безъядерная чешуйка плоского эпителия, характерная для гиперкератоза, – патологическое ороговение, избыточное накопление в цитоплазме белков–цитокератинов с удалением (разрушением) ядер поверхностных клеток многослойного плоского неороговевающего эпителия (рис. 7). Гиперкератоз относится к второстепенным признакам ПВИ. При АСМ отмечается колебание высоты в различных участках чешуйки от 500 до 800 нм.
Клетка плоскоклеточного рака шейки матки с ороговением (рис. 8) – причудливой формы, средних размеров, расположена изолированно; ядро умеренно увеличено, грубое, отмечается неравномерное распределение хроматина. На АСМ–изображении раковой клетки четко просматриваются более плотные участки цитоплазмы, которые характеризуются подъемом высоты до 2526 нм, что соответствует изображению на световом микроскопе зоны выраженного ороговения в участках с более темной цитоплазмой. В зоне менее выраженного ороговения высота поверхности клетки – 884 нм, высота в зоне ядра – 2754 нм. Участок цитоплазмы с ороговением имеет более выраженный рельеф. Степень ороговения коррелирует с высотой цитоплазмы, т.е. процесс ороговения приводит к увеличению высоты цитоплазмы. В раковых клетках отмечаются максимальные значения высоты поверхности: высота зоны ядра почти в 3 раза превышает ядерную зону нормальной клетки плоского эпителия, а высота зоны цитоплазмы превышает норму в 16 раз.
Таким образом, частота встречаемости различных типов ВПЧ, по нашим данным, составила: ВПЧ 18 типа – 38% (р>0,05), 16 типа – 17%, 6 типа – 10%, 56 типа – 6%, 66 типа – 4%, 31, 33, 45, 58 и 11 типов – 3%.
Исследование структуры эпителиальных клеток методом АСМ у женщин с ПВИ может повысить качество диагностики, способствовать лучшему выявлению ВПЧ–ассоциированных заболеваний и снижению частоты ложноотрицательных результатов цитологического исследования соскобов с шейки матки у пациенток с патологией эпителиальных клеток, вызванной ВПЧ.

Рис. 1. Частота выявления смешанной вирусной инфекции у обследованных женщин (%)
Рис. 2. Частота встречаемости различных типов генома ВПЧ у женщин с папилломовирусной инфекцией (%)
Рис. 3. Цитологическое исследование клетки плоского эпителия поверхностного слоя без признаков патологии
Рис. 4. Трехмерное изображение клетки при АСМ
Рис. 5. Трехмерное изображение койлоцита
Рис. 6. Перепад высот поверхности дискератоцита
Рис. 7. Гиперкератоз
Рис. 8. АСМ–изображение клетки плоскоклеточного рака шейки матки с ороговением


Нет комментариев. Ваш будет первым!

Тестовый баннер 468х60